زیست فناوری

نوشته: کسری اصفهانی

مهندسی تولید متابولیت‌های ثانویه
نویسنده : کسری اصفهانی - ساعت ۱۱:٥٠ ‎ق.ظ روز ۱۳۸٤/٧/٢٢
 

قسمت ۲

 

مسیرهای تولید متابولیت­های ثانویه

اسکلت کربنی متابولیت­های ثانویه از کربوهیدرات­ها تامین شده و طی فرآیند فتوسنتز ایجاد می­شود. متابولیت­های اولیه دیگری که در تولید متابولیت­های ثانویه نقش دارند، اسیدهای آمینه می­باشند. استیل کوآنزیم و اسید مِوالونیک نیز نقش مهمی در تولید انواع ترپنوئیدها دارند. مسیر اسید شیکیمیک نیز در تولید لیگنین­ها و ایندول آلکالوئیدها نقش­آفرینی می­کند. در شکل 1 مسیر  تولید چند گروه عمده از متابولیت­های ثانویه از متابولیت­های اولیه نشان داده شده است.

 

 

شکل 1: مسیر تولید مهم­ترین متابولیت­های ثانویه از متابولیت­های اولیه (4)

 

مهندسی تولید متابولیت­های ثانویه در گیاهان

در حال حاضر دستاوردهای زیاد و گوناگونی در مهندسی متابولیک متابولیت­های ثانویه به دست آمده است. مسیرهای بیوشیمیایی مختلفی با استفاده از ژن­های رمزکننده آنزیم­های مهندسی­شده و پروتئین­های تنظیمی بررسی شده­اند. در عین حال از ژن­های آنتی­سنس نیز برای مسدود کردن مسیرهای بیوشیمیایی و افزایش تولید متابولیت ثانویه خاصی استفاده می­شود.

متابولیت­های ثانویه وظایف مختلفی در طول چرخه زندگی گیاه دارند. از جمله این وظایف انجام نقش ترکیبات واسطه در برهم­کنش گیاه و محیط اطرافش و برهم­کنش گیاه با حشرات، ریزسازواره­ها و حتی گیاهان اطراف می­باشد.

تولید متابولیت­های ثانویه همچنین ممکن است بخشی از سامانه دفاعی گیاه باشد. این ترکیبات در تولیدمثل گیاهان نیز نقش دارند که از طریق جذب حشرات گرده­افشان این کار را انجام می­دهند.

متابولیت­های ثانویه گیاهی نقش مهمی در ایجاد کیفیت مواد غذایی (رنگ، طعم و بو) مختلف دارند. همچنین رنگ گیاهان زینتی و گلبرگ گل­ها که مهم­ترین خاصیت این گیاهان دسته از گیاهان است، توسط متابولیت­های ثانویه ایجاد می­شود. بسیاری از متابولیت­های ثانویه نیز برای تولید دارو، رنگ، حشره­کش­ها، طعم­دهنده­های غذایی و عطر استفاده می­شوند. به دلیل کاربردهای فراوان، متابولیت­های ثانویه موضوع جالبی برای تحقیقات اصلاح نباتات از طریق فنون ملکولی و مهندسی ژنتیک محسوب می­شوند.

در ده سال گذشته تحقیقات چندانی در ارتباط با متابولیت­های ثانویه انجام نشده­است. مانع بزرگ در انجام این تحقیقات، اطلاعات اندک از مسیرهای تولید زیستی متابولیت­های ثانویه و برهم­کنش آنزیم­های درگیر در این مسیر می­باشد. همچنین تعداد معدودی از ژن­های مربوط به متابولیت­های ثانویه در دسترس می­باشد.

یکی از مسیرهایی که مطالعات بیشتری در سطح ژن­های دست­اندرکار آن نسبت به دیگر متابولیت­های ثانویه انجام شده است، مسیر تولید فلاوونوئیدها و آنتوسیانین­ها می­باشد. اکثر ژن­های درگیر در مسیر تولید آنتوسیانین­ها همسانه­سازی شده و مطالعات فراوانی در سطح بیوشیمیایی، ملکولی و ژنتیک این دسته از متابولیت­های ثانویه صورت گرفته است. یکی از مهم­ترین دلایل مطالعات بیشتر در این زمینه، آسانی بررسی این مواد از روی رنگ گل­ها به فنوتیپ قابل غربال­گری می­باشد.

دیگر مسیر تولید متابولیت­های ثانویه که در سطح آنزیم­های درگیر و مواد واسط مورد مطالعه قرار گرفته است و اهمیت زیادی در داروسازی دارند، ایندول آلکالوئیدها هستند. اما در این مسیر هم ژن­های محدودی مشخص شده­اند.

هدف از مهندسی ژنتیک مسیر یک متابولیت ثانویه، افزایش مقدار یک ماده خاص یا گروهی از ترکیبات و یا حتی کاهش مقدار این ترکیبات می­باشد.

برای دستیابی به هدف دوم که کاهش میزان تولید یک ماده خاص یا گروهی از مواد ناخواسته می­باشد، راه­های مختلفی وجود دارد. ]این مواد ممکن است ترکیبات سمی در یک محصول گیاهی، مواد مانع خالص­سازی یک فرآورده صنعتی یا موادی از این دست باشد.[

یکی از این راه­ها، مسدود کردن یک مرحله از مسیر تولید متابولیت ثانویه و مختل کردن تولید یا فعالیت آنزیم مربوط به ان مرحله می­باشد. این هدف می­تواند با کاهش میزان mRNA مسئول تولید این آنزیم، با استفاده از فناوری آنتی­سنس، RNAi یا ابراز بالای یک آنتی­بادی علیه آنزیم مسئول محقق شود. فناوری آنتی­سنس به خوبی برای تغییر رنگ گل­ها استفاده شده است.

راه­های دیگر دستیابی به این هدف، تغییر مسیر به سوی مسیرهای موازی یا افزایش کاتابولیسم ماده نهایی می­باشد.

اما ممکن است هدف از انجام تحقیقات، افزایش تولید یک ترکیب خاص در گیاه بوده یا انتقال ژن­های مربوط به مسیر تولید یک متابولیت ثانویه به یک گیاه یا یک ریزسازواره مورد نظر باشد. همچنین ممکن است تولید یک ماده جدید که به صورت طبیعی در گیاهان تولید نشود، هدف یک پروژه تولیدی-پژوهشی باشد.

در برخی روش­ها با تغییر میزان ابراز یک یا چند ژن، بر موانع تولید یک ماده غلبه می­کنند و در روش­های دیگر، با حذف مسیرهای موازی (رقابتی) یا کاهش کاتابولیسم ماده مورد نظر، مقدار آن ماده را در گیاه می­افزایند.

ایجاد تغییراتی در ابراز ژن­های تنظیمی که کنترل مسیر تولید زیستی متابولیت­های ثانویه را بر عهده دارند نیز از جمله روش­های افزایش یا کاهش تولید ترکیب مورد نظر می­باشد.

در ادامه این مطلب برخی از نتایج به دست آمده از بررسی نحوه تولید متابولیت­های ثانویه، ژن­های مسئول و تنظیم ابراز ژن­های درگیر ارائه می­شود.

 

فلاوونوئیدها وآنتوسیانین­ها

 

ژن­های مسئول بیوسنتز فلاوونوئیدها وآنتوسیانین­ها

بیوسنتز فلاوونوئید و آنتوسیانین از اولین مسیرهای متابولیت­های ثانویه بود که مهندسی ژنتیک آنها صورت گرفت. دلیل این موضوع این بود که مسیر بیوسنتز آنها به خوبی شناخته شده بود و نتایج تغییرات انجام شده، به راحتی از روی تغییر رنگ گل­ها قابل مشاهده است.

آزمایش­های زیادی شامل افزایش ابراز ژن­های مختلف برای ایجاد رنگ­های جدید گل یا تولید ترکیبات جدید در گیاه انجام شده است.

به خاطر خواص آنتی­اکسیدانی این ترکیبات، افزایش میزان تولید و مقدار آنها در غذاهای گیاهی موضوع جالب توجهی برای دانشمندان بوده است. اکثر پژوهش­های انجام شده در زمینه بیوسنتز فلاوونوئیدها و آنتوسیانین­ها، در گیاه گوجه فرنگی صورت گرفته است.

مشخص شده است که آنزیمی از گروه ایزومراز به نام CHI، از آنزیم­های مراحل اولیه مسیر تولید فلاوونوئید، نقشی کلیدی در افزایش تولید فلاوونول دارد.

افزایش ابراز ژن CHI گیاه اطلسی، باعث افزایش سطح فلاوونوئید در پوست گوجه فرنگی به میزان 78 برابر می­شود. همچنین با تولید گیاهان گوجه فرنگی تراریخت، میزان فلاوونوئید آنها بیش از 20 برابر گیاهان شاهد بوده است. این موضوع حاکی از آن است که افزایش تولید ترکیبات مفید برای سلامتی، در محصولات حاصل از گوجه فرنگی امکان­پذیر می­باشد.

بیوسنتز ایزوفلاوون­ها که ترکیباتی ضد میکروبی هستند، بر اثر آلودگی میکروبی، در حبوبات القا می­شود. افزایش ابراز ژن ایزوفلاوون­سنتتاز که یک آنزیم سیتوکروم P450 می­باشد، باعث تولید این ترکیبات در آرابیداپسیس، توتون و ذرت که به طور عادی توانایی تولید این مواد را ندارند، می­شود. تولید این ترکیبات در این گیاهان بستگی به در دسترس بودن پیش­ماده­های مسیر فنیل پروپانوئید دارد. القا یا مهندسی این مسیر می­تواند در اصلاح و بهبود سامانه بیوسنتز ایزوفلاوون در گیاهان میزبان، مهم باشد.

 

ژن­های تنظیم کننده تولید فلاوونوئیدها وآنتوسیانین­ها

یک روش برای مهندسی ابراز ژن­های یک مسیر بیوشیمیایی، استفاده از عوامل رونویسی خاصی می­باشد که ژن­های مسیرهای بیوشیمیایی متعددی را کنترل می­کنند.

در دانه ذرت، تولید آنتوسیانین توسط ترکیبی از دو عامل رونویسی R و C1 تنظیم می­شود.

پروتئین­های R شباهت زیادی با پروتئین­هایی که توسط ژن­های مهره­داران رمز می­شود (ژن c-MYC) دارد در حالیکه پروتئین­های C1 مشابه محصولات ژن­های c-MYB می­باشد.

القا مسیر تولید فلاوونوئید با افزایش ابراز این دو عامل رونویسی R و C1 در سلول­های تمایز نیافته ذرت در محیط کشت صورت می­گیرد.

در برنج، افزایش ابراز این دو عامل رونویسی مربوط به گیاه ذرت، در کنار یک ژن دیگر، باعث فعال شدن مسیر بیوسنتز آنتوسیانین و همچنین افزایش مقاومت گیاه برنج به قارچ­ها می­شود.

در آرابیداپسیس، یک عامل رونویسی از نوع MYB به نام PAP1 تشخیص داده شده است که افزایش ابراز آن باعث تولید رنگدانه­های بنفش پررنگ در زمان نمو گیاه می­شود.

این مثال­ها نشان می­دهد که می­توان با افزایش ابراز یک یا چند عامل رونویسی (حتی با استفاده از ژن­های بیگانه در گیاه میزبان)، بر این سامانه قدرتمند تنظیمی ژنتیکی در هنگام نمو گیاه، غلبه کرد.

عوامل رونویسی گاهی به عنوان مانع ذخیره­سازی ترکیبات طبیعی نیز عمل می­نمایند.

غیرفعال سازی ژن عامل رونویسی MYB4 در آرابیداپسیس می­تواند باعث افزایش سطح موادی شود که تحمل گیاه را نسبت به تشعشعات اشعه ماورا بنفش می­افزایند.

افزایش ابراز ژن­های تولید کننده پروتئین FaMYB1 که از دسته پروتئین­های MYB می­باشد و از گیاه توت­فرنگی به توتون منتقل شده است، باعث کاهش تولید رنگدانه­های گل شده و سطح آنتوسیانین و فلاوونول در گیاه توتون پایین می­آید. تحلیل این اتفاق این گونه است که FaMYB1 در میوه توت­فرنگی به عنوان یک مانع در برخی از مراحل مسیر تولید فلاوونوئید عمل می­کند.

 

آلکالوئیدها

 

ژن­های بیوسنتز ایندول آلکالوئیدها

مسیر ترپنوئید ایندول آلکالوئید موضوع بسیاری از تحقیقات مهندسی ژنتیک بوده است چرا که حدود 15 نوع از ترکیبات این مسیر از نظر صنعتی اهمیت دارند که آلکالوئید ضد تومور وینبلاستین از آن جمله است.

 

 

شکل 2: ساختار مولکولی وینلاستین که از آلکالوئیدها می­باشد (4)

 

همه این آلکالوئیدها در یک قسمت از مسیر بیوشیمیایی تا تولید ماده واسط استریکتوزیدین مشترک هستند و از این نقطه، مسیر در گونه­های مختلف گیاهی تولید کننده مواد آلکالوئیدی منشعب می­شود.

 

 

شکل 3: مسیر مشترک بیوسنتز آلکالوئیدها (4)

 

بیشتر مطالعات انجام شده برای تهیه نقشه ژنتیکی بخش اولیه و مشترک مسیر و افزودن میزان ابراز ژن­های این بخش از مسیر بوده است. هدف از این کارها افزایش فعالیت مسیر تولید آلکالوئیدها می­باشد.

به طور مثال، ژن­های رمزکننده تریپتوفان دِکربوکسیلاز (TDC) و استریکتوزیدین سنتتاز (STR=SS) در کشت سلول­های گیاه Catharnthus roseus به خوبی مورد مطالعه قرار گرفته است.

افزایش ابراز TDC باعث افزایش ماده حدواسط تریپتامین شده در حالیکه به افزایش سطح آلکالوئیدها نمی­انجامد. اما با حضور STR، افزایش میزان آلکالوئیدها قابل ملاحظه است.

با افزودن ماده حدواسط تریپتوفان و ترپنوئیدها به محیط غذایی لاین­های سلولی مورد آزمایش، آنها ظرفیت تولید میزان بالایی از آلکالوئیدها را تا حدود یک میلی مول در لیتر بروز دادند. این موضوع به این معنی است که شاخه ترپنوئیدی مسیر بیوسنتز متوقف شده است. مطالعات تکمیلی نشان می­دهد که مراحل محدود کننده دیگری نیز وجود دارند که در اینجا از ذکر انها خودداری می­کنیم.

TDC و STR در گیاهان دیگری که مواد الکالوئیدی تولید نمی­کنند نیز ابراز می­شود. تغذیه کشت سلولی سلول­های گیاه توتون با سِکولوگانین، باعث تولید استریکتوزیدین شده اما این ماده که یک گلوکو آلکالوئید می­باشد، به جای ذخیره در واکوئل برای تولید ایندول آلکالوئید در مراحل بعدی (همانند آنچه در Catharnthus roseus اتفاق می­افتد)، به محیط کشت ترشح می­شود.

این موضوع اهمیت جنبه­های فیزیولوژیکی را در تولید زیستی متابولیت­های ثانویه نشان می­دهد به طوریکه نه تنها ژن­های رمز کننده آنزیم­های درگیر کاتالیز مراحل تولید زیستی در این امر مشارکت دارند بلکه ژن­های دیگری نیز از جمله ژن­های تنظیم pH و ژن­های مربوط به انتقال مواد نیز یک پای قضیه می­باشند.

 

ژن­های تنظیم کننده تولید ایندول آلکالوئید

دو عامل رونویسی به نام­های ORCA2 و ORCA3 که در چندین مرحله از مسیر بیوشیمیایی تولید آلکالوئید در Catharnthus roseus نقش تنظیمی دارند، تعیین شده­اند.

افزایش ابراز ORCA3 به تنهایی باعث افزایش تولید آلکالوئیدها نمی­گردد چرا که این عامل رونویسی، ژن G10H را که یک آنزیم سیتوکروم P450 موثر در کاتالیز مرحله اول تولید سِکولوگانین می­باشد، تنظیم نمی­کند. اما پس از تغذیه سلول­ها با پیش­ماده سِکولوگانین که همان لوگانین می­باشد، تولید آلکالوئیدها تا میزان 3 برابر افزایش می­یابد.

هر دو این عوامل تنظیمی (ORCA2 و ORCA3) درگیر تولید زیستی ترپنوئید ایندول آلکالوئید بوده گرچه کنترلی بر ژن G10H ندارند. این موضوع نشان می­دهد که ژن­های دیگری نیز درگیر تنظیم فعالیت این مسیر می­باشند که می­تواند موضوع پژوهش­های بعدی در این زمینه باشد.

نتایج تمامی این مطالعات یک پیام مهم را نیز داشت؛ برای افزایش ابراز یک دسته از آنزیم­های درگیر در یک مسیر بیوشیمیایی می­توان از ژن­های تنظیمی استفاده نمود به جای آنکه ابراز هر یک از ژن­ها را به طور جداگانه افزایش داد.

 

منابع:

 

1.        Ramawat KG, Merillon JM (1999) Biotechnology; Secondary Metabolites. Science Publisher, NH, USA.

2.        Fiechter A (1990) Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. Springer-Verlag, Berlin.

3.        Vanisree M, Lee CY, Lo SF, Nalawade SM, Lin CY, Tsay HS (2004) Studies on the production of some important secondary metabolites from medical plants by plant tissue cultures. Bot. Bull. Acad. Sin. 45:1-22.

4.        Verpoorte R, Memelink J (2002) Engineering secondary metabolite production in plants. Curr Opin Biotechnol, 13:181-187.

5.        Dixon RA (2001) Natural products and plant disease resistance. Nature, 411:843-847.

6.        Forkmann G, Martens S (2001) Metabolic engineering and application of flavonoids. Curr Opin Biotechnol, 12:155-160.


 
comment نظرات ()
 
مهندسی تولید متابولیت‌های ثانویه
نویسنده : کسری اصفهانی - ساعت ۱۱:٥٧ ‎ق.ظ روز ۱۳۸٤/٧/۱٧
 

 

قسمت اول

بعضی از موجودات زنده خصوصاً گیاهان، طیف وسیعی از ترکیباتی موسوم به متابولیت­های ثانویه را تولید می­کنند. در مفهوم کلی، متابولیت­های ثانویه ترکیباتی آلی هستند که نقش ضروری در رشد و نمو موجود زنده ندارند.

گیاهان برای بیوسنتز این مواد انرژی زیادی را به کار می­برند. زمانی که این ترکیبات اثری بر رشد و تمایز گیاه نداشته باشند، قاعدتاً باید منافع دیگری داشته باشند. مطالعه در زمینه وظایف این ترکیبات در گیاهان، یک موضوع جذاب و مهم برای بسیاری از پروژه­های تحقیقاتی شده است و نقش­های اکولوژیکی تعدادی از این ترکیبات مورد بررسی و تحقیق قرار گرفته است. با مطالعاتی که تاکنون صورت گرفته است، به نظر می­رسد که متابولیت­های ثانویه، به عنوان موادی طبیعی، نقش­های اکولوژیکی مهمی در واکنش­های دفاعی گیاهان و همچنین گرده­افشانی و انتشار دانه­های گیاهان به وسیله حشرات و حیوانات دارند.

بعضی از این ترکیبات به عنوان علف­کش و حشره­کش­ در صنعت استفاده می­شوند در حالیکه برخی دیگر کاربرد صنعتی ندارند. دسته بزرگی از متابولیت­های ثانویه کاربرد دارویی و پزشکی دارند. ترکیباتی دیگری از این گروه نیز نقش مهمی در تغذیه انسان و دام دارند.

 

تفاوت­های متابولیت­های ثانویه با متابولیت­های اولیه

سلول­ها خصوصاً سلول­های گیاهی دو دسته از ترکیبات را تولید می­کنند؛ متابولیت­های اولیه و متابولیت­های ثانویه.

 متابولیت­های اولیه

متابولیت­های اولیه مستقیماً در رشد و متابولیسم درگیر هستند و شامل کربوهیدرات­ها، لیپیدها، پروتئین­ها و اسیدهای نوکلئیک می­شوند.

در گیاهان متابولیت­های اولیه طی فرآیند فتوسنتز تولید شده و سپس در ساخت ترکیبات سلول نقش­آفرینی می­کنند. این ترکیبات در حجم زیاد و با ارزش اقتصادی پایین تولید می­شوند و عمدتاً به عنوان ماده خام صنعت، مواد غذایی و افزودنی­ها کاربرد دارند. روغن­های گیاهی، اسیدهای چرب (برای ساخت صابون و شوینده­ها) و کربوهیدرات­هایی مانند ساکاروز، نشاسته، پکتین و سلولز مثال­هایی از متابولیت­های اولیه هستند. قیمت این قبیل ترکیبات به طور میانگین دو دلار در هر کیلو بوده و تولید آنها در حجم انبوه امکان­پذیر است.  البته برخی از متابولیت­های اولیه مانند میواینوزیتول و بتاکاروتن گران هستند که علت قیمت بالای آنها، سختی استخراج و تخلیص آنها می­باشد.

 متابولیت­های ثانویه

متابولیت­های ثانویه از بیوسنتز متابولیت­های اولیه به دست می­آیند و به عنوان ترکیبات فرعی و انتهایی متابولیسم اولیه در نظر گرفته می­شوند. همچنین این ترکیبات در فرآیندهای متابولیسمی وارد نمی­شوند. مهمترین متابولیت­های ثانویه آلکالوئیدها، فنولیک­ها، روغن­های ضروری، استروئیدها، لیگنین­ها، تانن­ها، فلاوونوئیدها می­باشند.

متابولیت­های ثانویه عمدتاً در گونه­ها و خانواده­های خاصی از سلسله گیاهان تولید می­شوند. این ترکیبات به مقدار کمی در سلول ذخیره شده و عمدتاً در سلول­های تخصصی و در مرحله خاصی از چرخه زندگی گیاه تولید می­شوند و همین امر استخراج و تلخیص آنها را در مقایسه با متابولیت­های اولیه که در تمام سلول­ها تولید می­شوند، دشوار می­کند.

گیاهان دارویی از لحاظ میزان متابولیت­های ثانویه بسیار غنی می­باشند و ترکیبات آنها را در انگلیسی Medicinal یا Officinal می­نامند. این ترکیبات که از گروه متابولیت­های ثانویه می­باشند، اثرات فیزیولوژیکی عمیقی بر پستانداران دارند و از مهم­ترین ترکیبات دارویی هستند.

از این گیاهان و اثرات فیزیولوژیک ترکیبات موثره آنها به عنوان داروی خوراکی استفاده شده و در نتیجه این ترکیبات، داروهای گیاهی یا داروهای طبیعی نام گرفته­اند.

استفاده از داروهای با منشا گیاهی بدون انجام فرآوری خاصی، یعنی استفاده از پودر گیاه یا مواد موثره آن بدون خالص­سازی عصاره گیاهی، از قدیم رواج داشته و حتی در حال حاضر و در پزشکی مدرن از طیف وسیعی از داروهای با منشا گیاهی استفاده می­شود. گرچه تعدادی از این داروها به طور مصنوعی برای مصارف ساخته می­شوند ولی هنوز بسیاری از آنها از منابع طبیعی به دست می­آیند.

به محض اینکه اثر فیزیولوژیک یک گیاه دارویی خاص کشف شود، تلاش­ها برای یافتن خصوصیات دقیق شیمیایی ماده موثره آن (داروی گیاهی) و در پی آن، یافتن روش تولید شیمیایی این ترکیبات به طور تجارتی صورت می­گیرد.

برای تعیین خصوصیات شیمیایی و شناسایی یک متابولیت ثانویه، جداسازی آن به صورت کاملاً خالص الزامی و اولین قدم است. روش­های جداسازی گوناگون و مراحل آن اکثراً طولانی است.

متابولیت­های ثانویه به صورت خالص و با نسبت­های مشخص در پزشکی استفاده می­شوند. البته در کنار خالص سازی مواد موثره گیاهان دارویی، آنها بدون تغییر نیز در سامانه­های مختلف تهیه دارو استفاده می­شوند.

این نکته را نباید فراموش کرد که در کنار متابولیت­های ثانویه، تعدادی از متابولیت­های اولیه نیز اثرات فیزیولوژیکی قوی دارند. اکثر این ترکیبات پروتئینی بوده و عملکردهای مختلفی دارند. هورمون­ها و زهر مارها مثال­هایی از پروتئین­های با اثرات فیزیولوژیکی قوی هستند. آنتی­بیوتیک­ها، واکسن­ها و تعدادی از پلی­ساکاریدها که نقش هورمونی دارند، از جمله متابولیت­های اولیه با اثر فیزیولوژیکی قابل ملاحظه می­باشند.


 
comment نظرات ()