زیست فناوری

نوشته: کسری اصفهانی

چه مقدار DNA می‌تواند از آگروباکتریوم به گیاهان منتقل شود؟
نویسنده : کسری اصفهانی - ساعت ۱:۱٧ ‎ب.ظ روز ۱۳۸٥/٥/۱۸
 

ناحیه T پلاسمیدهای Ti و Ri طبیعی به اندازه کافی برای رمز کردن تا ده­ها ژن بزرگ است. به عنوان مثال، اندازه ناحیه T پلاسمید pTiC58 تقریباً 23 کیلو باز است. به علاوه، برخی پلاسمیدهای Ti و Ri دارای چندین ناحیه Ti بوده که هر کدام می­توانند به تنهایی یا با بقیه به گیاه منتقل شوند. در کارهای مهندسی ژنتیک، دانشمندان ممکن است بخواهند تا قطعه بزرگی از T-DNA که ظرفیت رمز کردن چندین محصول ژن­های مربوط به یک مسیر بیوشیمیایی را داشته باشد به گیاه منتقل کنند. در حالت دیگر، ورود مجدد ناحیه بزرگی از ژنوم گیاهی به یک گیاه جهش­یافته، ممکن است برای تعیین مسئولیت ژن­ها در یک فنوتیپ خاص، از طریق روش تکمیل ژنتیکی[1]، مفید باشد. حال سوال این است؛ چه اندازه از ناحیه T می­تواند به گیاه منتقل شود؟

Miranda و همکارانش نشان دادند که با تغییر جهت یک حاشیه راست T-DNA، می­توان یک پلاسمید Ti کامل را با اندازه­ای در حدود 200 کیلو باز به گیاه منتقل کرد. گرچه این موضوع به ندرت اتفاق می­افتد، ولی این مطالعه نشان می­دهد که مولکول­های بسیار بزرگ DNA می­توانند به واسطه آگروباکتریوم به گیاه منتقل شوند. Hamilton و همکارانش، برای اولین بار با استفاده از "سیستم دوتایی کروموزوم مصنوعی باکتری"[2] (BIBAC) مولکول­های بزرگ DNA را از آگروباکتریوم به گیاه منتقل کردند. همین گروه نشان دادند که همسانه DNA 150 کیلو بازی انسانی می­تواند با استفاده از این سیستم به گیاه منتقل شود. گرچه برای کارآیی انتقال قطعه­ DNAای به این بزرگی، ابراز بالای virG  یا virG و virE. تواماً نیاز است. VirE2 یک پروتئین متصل شونده به DNA تک رشته را رمز می­کند که T-DNA را از تجزیه در سلول گیاهی محافظت می­کند. چون virG یک فعال­کننده رونویسی برای اپران­های vir می­باشد، ابراز نسخه­های اضافی این تنظیم کننده ژن­های vir باعث افزایش ابراز VirE2 و سایر پروتئین­های Vir درگیر در انتقال T-DNA می­شود. ابراز بالای virE بخشی از سیستم BIBAC را تشکیل می­دهد که برای انتقال قطعات بزرگ DNA (30 تا 150 کیلو باز) به توتون و گیاهان سرسخت­تر گوجه­فرنگی و Brassica استفاده می­شود. به هر حال، انتقال T-DNAهایی با اندازه­های متفاوت از سویه­های گوناگون آگروباکتریوم، شرایط متفاوت ابراز بالای virG و virE می­طلبد. Liu و همکارانش یک سیستم مستعد انتقال ژن ناقل کروموزوم مصنوعی را بر مبنای منشا همانندسازی P1 ابداع کرده و از آن برای تولید کتابخانه­های مولکول­های بزرگ DNA (40 تا 120 کیلو باز) گیاهان گندم و آرابیداپسیس استفاده کردند. این سیستم به ابراز بالای virG و virE برای انتقال صحیح قطعه بزرگ به آرابیداپسیس نیازی ندارد.


[1] Genetic Complementation

[2] Binary BAC (BIBAC) system


 
comment نظرات ()
 
این وبلاگ یک وبلاگ علمی است!
نویسنده : کسری اصفهانی - ساعت ٤:۳٢ ‎ب.ظ روز ۱۳۸٥/٥/٩
 

گرچه این وبلاگ یک وبلاگ علمی است ولی آیا می توان این همه جنایت در دنیا را دید و دم فرو بست. شاید چون ما مسلمانیم این همه به قضیه لبنان حساسیم و با دیدن عکسهای فجایج اسرائیل بدنمان می لرزد. اما در کامبوج نیز ۲ میلیون نفر توسط خمرهای سرخ کشته شدند و عامل آن همین هفته پیش درگذشت.

چیزی که برایم جالب است، انفعال سازمان ملل در برابر فجایع لبنان و بررسی پرونده اتمی ایران در شورای امنیت در این موقعیت است. باید برای این دنیا و این سازمان ملل و دبیر کل بی عرضه آن گریست و البته ما در این دنیا زندگی می‌کنیم. عادت کرده ایم که اسرائیل می تواند همه گونه سلاح داشته باشد ولی ایران و حزب الله نه! اسرائیل با سلاحهای آمریکایی مردم لبنان و فلسطین را بکشد ولی ایران حق ارسال سلاح به لبنان ندارد!

اما موضوع دیگری که توجه مرا در این چند روز جلب کرد، واکنش خوب دستگاه دیپلماسی کشورمان بود. انفعال دنیای عرب، موقعیت ممتازی برای ایران در کسب محبوبیت در دنیای اسلام فراهم کرده است. وقار سید حسن نصر الله هم لذت بخش است که می گوید ما از هیچ کشور عربی کمک نمی خواهیم حداقل حرکت اسرائیل را محکوم کنید.

واکنش برادران مسلمان(!) عربمان را ببینید. ما در این دنیا تنها هستیم و فقط خودمان را داریم. باید قوی شویم. فراموش نکنیم که مردم آلمان ویرانه کشوری را تحویل گرفته و در نیم قرن آن را به یکی از قدرتهای جهان تبدیل کردند. آنها پس از پایان جنگ، کشتی های حامل مواد غذایی را از بنادر خود پس فرستادند و گفتند: مردم آلمان کمک هیچ کشور دیگری را لازم ندارند، حتی اگر گرسنه و جنگ زده باشند.


 
comment نظرات ()
 
چگونه T-DNA از آگروباکتریوم به سلول‌های گیاهی منتقل می‌شود؟
نویسنده : کسری اصفهانی - ساعت ۱۱:۳٦ ‎ق.ظ روز ۱۳۸٥/٥/٤
 

قسمت دوم

VirD4 به همراه 11 پروتئین VirB، یک سیستم ترشحی نوع 4 که برای انتفال T-DNA و چند پروتئین­ دیگر Virشامل VirE2 و VirF لازم است، می­سازند. شـایـد VirD4 بـه عنــوان یـک پیونـددهنـده عمـل نمـایـد تـا برهمکنــش مـجـمـوعـه T-DNA/VirD2 با سیستم ترشحی رمزشده VirB را افزایش دهد. بیشتر پروتئین­های VirB یا کانال غشایی می­سازند یا به عنوان ATPase، انرژی لازم برای تشکیل کانال یا فرآیندهای خروج مولکول­ها را فراهم می­کنند. چندین پروتئین شامل VirB2، VirB5 و احتمالاً VirB7 در ساختن T-pilus شرکت دارند. VirB2 اصلی­ترین پروتئین پیلین[1] است. عمل پیلوس[2] در انتقال T-DNA هنوز روشن نیست، ولی شاید به عنوان کانالی برای عبور T-DNA و پروتئین­های Vir عمل نماید یا شاید فقط به عنوان قلابی برای برقراری ارتباط با سلول گیاهی پذیرنده عمل نمایند و باکتری و گیاه در نزدیکی هم قرار داده تا انتقال مولکولی موثری صورت گیرد. جنبه مهم زیست­شناسی پیلوس که شاید در انتقال ژن اهمیت داشته باشد، ناپایداری آن در حرارت است. گرچه حداکثر القا ژن­های vir در دمای 25 تا 27 درجه است، پیلوس برخی از سویه­های آگروباکتریوم در دماهای پایین­تر (18 تا 20 درجه)، پایدارتر است. آزمایش­های اولیه حاکی از اثر درجه حرارت بر انتقال ژن است. بدین ترتیب، برخی شاید کشت همزمان آگروباکتریوم و سلول­های گیاهی را در دمای پایین و طی چند روز آغازین فرآیند انتقال ژن مورد بررسی قرار دهند.

پروتئین­های VirD2 و VirE2نقشی حیاتی و احتمالاً کامل­کننده در انتقال ژن به واسطه آگروباکتریوم بازی می­کنند. گفته می­شود که این دو پروتئین به همراه رشته T، مجموعه­ای به نام مجموعه T[3] تشکیل می­دهند که شکل انتقال شونده T-DNA می­باشد. اینکه این مجموعه داخل باکتری سوار می­شود یا نه هنوز مورد مباحثه است. Citovsky و همکارانش نشان داده­اند که VirE2 می­تواند داخل سلول گیاهی کار خود را انجام دهد: گیاهان تراریخته توتون که توانایی ابراز VirE2  را کسب کرده بودند، با سویه­های جهش­یافته virE2 آگروباکتریوم آلوده می­شدند. چندین آزمایشگاه نیز نشان داده­اند که VirE2 می­تواند در غیاب رشته T به سلول گیاهی منتقل شود و ممکن است که مجموعه VirE2 و رشته T، یا در کانال انتقال باکتری یا داخل سلول گیاهی تشکیل شوند. نتایج تحقیقات جدید حاکی از آن است که شاید VirE2 نقش دیگری نیز در مراحل اولیه فرآیند انتقال ژن دارد: Dumas و همکارانش نشان داده­اند که VirE2 در شرایط in vitro می­تواند با مشارکت غشا مصنوعی، کانالی برای انتقال مولکول­های DNA خلق نمایند. بنابراین، ممکن است که یک وظیفه VirE2، تشکیل سوراخی در غشا سیتوپلاسمی برای تسهیل عبور رشته T باشد. به دلیل اتصال VirD2 به انتهای 5' رشته T، این پروتئین ممکن است به عنوان راهنمای این رشته برای عبور از کانال انتقالی نوع 4 عمل نماید. VirD2 همچنین ممکن است در مراحل دیگری از فرآیند انتقال ژن، در داخل سلول گیاهی، نقش داشته باشد. VirD2 دارای توالی "پیام مکان­یابی هسته­ای" (NLS)[4] بوده که ممکن است در هدایت این پروتئین و T-DNA متصل به آن به سوی هسته سلول گیاهی، کمک نماید. توالی NLS در پروتئین VirD2 می­تواند مجموعه­های T ساخته­شده در آزمایشگاه که شامل پروتئین­های گزارشگر نیز می­باشند، به هسته سلول­های گیاه، جانور و مخمر هدایت کند. از این گذشته، VirD2 می­تواند با چندین پروتئین Importin-[5] آرابیداپسیس از طریقی وابسته به NLS در مخمر و همچنین شرایط in vitro مشارکت نماید. Importin- بخشی از یکی از مسیرهای انتقال پروتئین هسته­ای است که در یوکاریوت­ها کشف شده است. داده­های اخیر نشان می­دهد که VirD2 به تنهایی برای انتقال مستقیم رشته T به هسته کافی نیست. Ziemienowicz و همکارانش نشان دادند که در سلول­های تراوا، VirD2  می­تواند در انتقال اولیگونوکلئوتیدهای کوچـک متصل به خـود، که در شرایـط in vitro  ساخته شده­اند، به هسته موثر باشد، ولی نمی­تواند مولکول­های بزرگ متصل را در انتقال به هسته هدایت کند. برای انتقال این مولکول­های بزرگ­تر، VirE2 نیز باید به رشته T ملحق شود. نهایتاً شاید VirD2 نقشی در ادغام T-DNA با ژنوم گیاهی بازی کند. جهش­های متعددی در VirD2 می­تواند هم در کارآیی و هم در دقت ادغام T-DNA تاثیر داشته باشند.

درباره نقش VirE2 در انتقال هسته­ای T-DNA هم مباحثاتی وجود دارد. VirE2 یک پروتئین متصل شوند به توالی­های غیر اختصاصی DNA تک رشته می­باشد. در سلول­های آگروباکتریوم VirE2 شاید با VirE1 برهمکنش داشته باشد و بنابراین نمی­تواند برای اتصال به T-DNA در دسترس باشد. اما وقتی به DNA تک رشته متصل شود (احتمالاً در سلول گیاهی)، VirE2 می­تواند DNA با ساختار پیچیده اتفاقی را تبدیل به حالتی شبیه به سیم پیچیده تلفن نماید. این شکل طویل شده T-DNA، ممکن است به هدایت آن از طریق سوراخ­های هسته کمک نماید. VirE2 همچنین دارای توالی­های NLS بوده که ابه این دلیل می­تواند پروتئین­های گزارشگر متصل به خود را به هسته سلول گیاه هدایت کند. VirE2 مثل VirD2 با پروتئین­های Importin- آرابیداپسیس در مخمر، از طریقی وابسته به NLS برهمکنش دارد. یک گزارش حاکی از آن است که VirE2 به DNA تک­رشته متصل شده و با ریز-تزریقی به داخل سلول گیاهی، می­تواند DNA را به هسته هدایت کند، گرچه گزارش­های دیگر نشان می­دهد که VirE2 نمی­تواند DNA تک­رشته متصل به خود را به هسته سلول­های گیاهی یا جانوری که برای افزایش کارآیی جذب DNA از محیط، تراوا گشته­اند، رهنمون سازد. دلایل این نتایج متناقض نامعلوم است ولی شاید منعکس­کننده تفاوت­های نوع سلول­ها و سیستم­های ارسال DNA که توسط دو گروه استفاده شده، باشد. استفاده از سویه­های آگروباکتریوم که یک پروتئین VirD2 جهش­یافته فاقد NLS را رمز می­کنند، برای ارسال T-DNA به سلول گیاهی، فقط باعث 40 درصد کاهش کارآیی انتقال ژن می­شود. گیاهان تراریخته که VirE2 را ابراز می­کنند، مکمل سویه­های جهش­یافته­های دوگانه آگروباکتریوم هستند که فاقد ژن  virE2 و دارای یک نقص در ناحیه رمزکننده NLS ژن  virD2 می­باشند. این نتایج نشان می­دهد که در صورت فقدان توالی NLS در پروتئین VirD2، سایر سازوکارهای هدف­گیری هسته (مثل VirE2) جایگزین آن می­شوند.

وقتی VirE2 به DNA متصل می­شود، موتیف NLS آن مسدود و غیرفعال می­شود. این موضوع به این علت است که دامنه­ NLS و دامنه متصل شونده به DNA پروتئین VirE2 با هم همپوشانی دارند. گروه Hohn نظریه­ای ارائه کرده­اند که طبق آن نقش اولیه VirE2 در انتقال هسته­ای مستقل از NLS بوده و VirE2 فقط به رشته T شکل می­دهد تا بتواند از منافذ هسته با حرکات مارپیچی عبور کند.

توانایی پروتئین VirE2 در مکان­یابی هسته سلول­های جانوری مورد بحث است. Ziemienowicz و همکارانش نشان داده­اند که در سلول­های تراوا شده Hela، نوع octopine پروتئین VirE2 می­تواند هسته را هدف­گیری نماید در حالی که در سلول­های Drosophila و Xenopus که مورد ریزتزریقی قرار گرفته بودند، توالی NLS نوع nopaline پروتئین VirE2 باید تغییر نماید تا این پروتئین تغییریافته در مکان­یابی هسته­ای موثر باشد. گرچه دلیل این اختلاف مشخص نیست ولی احتمالاً به خاطر این نیست که یکی از دو گروه از VirE2 نوع octopine و دیگری از نوع nopaline استفاده کردند.

نهایتاً VirE2 احتمالاً رشته T را از تجزیه نوکلئوتیدی در سیتوپلاسم و هسته گیاه محافظت می­کند.

وجود یک مجموعه T مرکب از یک تک مولکول VirD2 که با پیوند کووالانت به انتهای 5' یک رشته T متصل شده است و به طور منظم توسط مولکول­های VirE2 پوشیده شده است، به طور کلی توسط مجامع تحقیقاتی آگروباکتریوم پذیرفته شده است. اما بهتر است آگاه باشیم که این مجموعه تاکنون نه در آگروباکتریوم و نه در سلول­های گیاهی شناسایی نشده است. همچنین ممکن است سایر پروتئین­ها مثل Importin، VIP1 و حتی VirF، هم به طور مستقیم و غیر مستقیم با رشته T برهمکنش داشته و مجموعه T طویل­تری در سلول گیاهی تشکیل دهند.

گرچه عموماً ژن­هایvir  رمز شونده توسط پلاسمید Ti به عنوان مهم­ترین عامل انتقال ژن مورد توجه هستند، بسیاری از ژن­های کروموزومی آگروباکتریوم نیز برای این فرآیند ضروری هستند. نقش ژن­های کروموزومی برای اولین بار با استفاده از جهش­زایی اتفاقی کل ژنوم آگروباکتریوم مشخص شد. تحقیقات بعدی نقش بسیاری از این ژن­ها را مشخص کرد. این نقش­ها شامل تولید، تغییر و ترشح اگزو-پلی­ساکارید (pscA/exoC، chvA و chvB) و دیگر نقش­ها در اتصال باکتری به سلول­های گیاهی (ژن­های att)، ناقلین قند درگیر در القا ژن­های vir (chvE)، تنظیم القا ژن­های vir (chvD) و حمل T-DNA (acvB) می­باشد. ژن­های دیگر مثل miaA، نیز ممکن است نقش کوچکی در فرآیند انتقال ژن داشته باشند. روشن­شدن توالی کامل A. tumefaciens C58، مطمئناً بستر مناسبی برای کشف ژن­های دیگری که در انتقال ژن به واسطه آگروباکتریوم درگیر هستند، فراهم می­کند.



[1] Pilin

[2] Pilus

[3] T-complex

[4] Nuclear Localization Signal

[5] Importin- proteins


 
comment نظرات ()