زیست فناوری

نوشته: کسری اصفهانی

آزمایش های اولیه ابراز تراژن ها در گیاهان با استفاده از عناصری مانند پیشبرها
نویسنده : دکتر کسری اصفهانی - ساعت ٢:٠٥ ‎ب.ظ روز ۱۳٩٢/٧/٢٧
 

آزمایش­های اولیه ابراز تراژن­ها در گیاهان با استفاده از عناصری مانند پیشبرهای 35S، 19S و opine synthase که باعث ابراز نسبتاً دائمی تراژن­ها می­شوند، صورت گرفته است. چون آزمایش­های مهندسی ژنتیک گیاهی با تصحیحاتی روبرو شده­اند، دانشمندان بر آن شدند تا از پیشبرهای تنظیم­شونده که باعث ابراز ترا­ژن در شرایط خاص محیطی، بافت­های خاص یا مراحل خاص نمو می­شوند، استفاده کنند. سیستم­هایی نیز تهیه شده­اند که به دانشمندان اجازه می­دهد تا ابراز تراژن را به دلخواه القا کنند، ابراز بالای یک محصول خاص را داشته باشند یا یک محصول را بیان کنند که شاید در یک مرحله خاص از نمو برای گیاه سمی باشد. این سیستم­های القاشونده با تتراسایکلین، الکل، مس، شوک گرمایی و هورمون­های استروئیدی تنظیم می­شوند. بسیاری از این سیستم­ها دارای مشکل بوده و باعث ابراز تراژن در شرایط غیر القایی می­شوند.

برخی اوقات محققان نمی­خواهند که تراژن یا محصول آن در چند ساعت یا چند روز اول پس از انتقال ژن حضور داشته باشند. برخی صفات مثل آنهایی که در طی انتقال ژن به این فرآیند کمک می­کنند یا بر بازآرایی DNA گیاهی اثر دارند، فقط در اوایل واقعه انتقال ژن مورد نیاز هستند (سیستم­های site-specific recombinaseمورد استفاده در هدف­یابی ژن). دو راهبرد هستند که فقط اجازه ابراز موقت محصولات را در گیاهان می­دهند. این دو سیستم­های "غیر ادغام شونده"[1] T-DNA و انتقال پروتئین­ها به جای مولکول­های DNA از آگروباکتریوم به سلول­های گیاهی می­باشند.

سیستم­های غیر ادغامی T-DNA شامل استفاده از سویه­های جهش­یافته آگروباکتریوم یا سلول­های گیاهی می­باشد که کارآیی بالایی در انتقال هسته­ای T-DNA داشته ولی در ادغام T-DNA ناکارا هستند. در طی جستجو برای یافتن دامنه­هایی از VirD2 که برای هدف­یابی هسته­ای T-DNA لازم هستند، Shurvinton وهمکارانش یک دامنه پایانه-C[2] را که مشابهت بالایی در توالی­های اسید آمینه­ها در بین ژن­های virD2 نشان می­داد، مشخص کرده و آن را ω نامگذاری کردند. گرچه این دامنه نه در فعالیت اندونوکلئازی VirD2 و نه در هدف­یابی هسته­ای T-DNA لازم می­باشد، جایگزینی 4 اسید آمینه حفاظت­شده[3] آن با دو گروه سرین منجر به یک پروتئین جهش­یافته شد و رمز شدن آن در سویه آگروباکتریوم، باعث کاهش بسیار زیاد بیماری­زایی گردید. در ادامه Narasimhulu و همکارانش و Mysore و همکارانش نشان دادند که سویه­های آگروباکتریومی که این VirD2ω  جایگزین را حمل می­کنند، در انتقال ژن پایدار ناکارآمد بوده (2 درصد کارآیی سویه­های طبیعی) ولی هنوز توانایی انتقال ژن موقت به سلول­های گیاهی را تا 20 درصد کارآیی سویه­های طبیعی، حفظ کرده بودند. بنابراین، این جهش باعث کاهش قابل توجه کارآیی ادغام T-DNA در سویه­های آگروباکتریوم شده ولی نسبتاً کارآیی ارسال T-DNA به هسته گیاهی حفظ می­شود. این پروتئین جهش­یافته VirD2 می­تواند برای هدف­گیری رشته T به هسته استفاده شده و در آنجا بدون اینکه ادغام با کارآیی بالایی صورت گیرد، به طور موقت ابراز شود.

Nam و همکارانش 40 اکوتیپ A. thaliana را از لحاظ توانایی انتقال ژن به ریشه توسط آگروباکتریوم غربال کردند. در این میان، اکوتیپ UE-1 به راحتی انتقال ژن موقت در آن صورت می­گرفت ولی انتقال ژن پایدار در آن پایین بود. تعیین خصوصیات ژنتیکی و مولکولی این اکوتیپ نشان داد که انسداد در انتقال ژن در مرحله ادغام T-DNA صورت می­گیرد. تحقیقات بعدی Nam و همکارانش باعث شناسایی تعداد زیادی جهش­یافته با ورود T-DNA (rat) شدند که در مقابل انتقال ژن به واسطه آگروباکتریوم مقاوم بودند. در میان 21 جهش­یافته اولیه، پنج جهش­یافته کارآیی انتقال ژن موقت را داشتند ولی انتقال ژن دائم به آنها بسیار سخت بود، و یک فنوتیپ ناکارآیی در ادغام T-DNA را بروز می­دادند. Mysore و همکارانش یکی از این جهش­یافته­ها را به نام rat5 مورد بررسی دقیق قرار دادند. این جهش­یافته با وارد کردن یک T-DNA به ناحیه غیر ترجمه شونده 3' یک ژن هیستون H2A به نام HTA1 تولید شده بود. داده­های بیوشیمیایی و مولکولی نشان می­داد که انتقال ژن موقت به خوبی به این جهش­یافته صورت گرفته ولی ادغام T-DNA مختل شده بود. هر چند که نقش دقیق ژن HTA1 در ادغام T-DNA کامل روشن نشده است، انتقال ژن به ریشه این جهش­یافته (و سایر جهش­یافته­های ناکارآ در ادغام T-DAN) می­تواند برای ارسال موقت T-DNA بدون ادغام کارآمد آن استفاده شود. استفاده از ژن HTA1 برای بهبود کارآی انتقال ژن به گیاهان طبیعی در ادامه شرح داده خواهد شد.

Vergunst و همکارانش روش جدیدی برای انتقال پروتئین به طور مستقیم از آگروباکتریوم به سلول گیاهی ارائه کرده­اند. این سیستم بر اساس توانایی سیستم ترشح پروتئین نوع IV است که توسط ژن­های virB و virD4 آگروباکتریوم برای انتقال بعضی پروتئین­های Vir به سلول­های گیاهی رمز می­شود. VirD2، VirE2 و VirF سه پروتئینی هستند که تاکنون توانایی این سیستم در انتقال آنها مشخص شده است. محققان این گروه نشان داده­اند که ترکیب ترجمه­ای یک پروتئین Cre recombinase به پایانه N پروتئین­های VirE2 و VirF، به سلول­های گیاهی منتقل شده و بر نوترکیبی در جایگاه lox تاثیر می­گذارد. آنها همچنین نشان داده­اند که 37 اسید آمینه پایانه C پروتئین VirF برای انتقال کارآمد پروتئین­های ترکیبی کافی می­باشد. این آزمایش­ها به استفاده از پروتئین­های Vir به عنوان حاملی برای وارد کردن موقت سایر پروتئین­ها به داخل سلول گیاهی، منجر خواهد شد.



[1] Nonintegrating

[2] C-terminal

[3] Conserved

 

مطلب قبلی در این زمینه: استفاده از سرکوب گرهای ویروسی خاموشی ژن برای افزایش ابراز ژن تراریخته

Refrence: Stanton B. Gelvin (2003), Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the "Gene-Jockeying" Tool. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67:16-37.


 
comment نظرات ()
 
استفاده از سرکوب گرهای ویروسی خاموشی ژن برای افزایش ابراز ژن تراریخته
نویسنده : دکتر کسری اصفهانی - ساعت ۱۱:٤۳ ‎ق.ظ روز ۱۳٩٢/۱/٢٤
 

داده­های حاصل از تحقیقات چندین آزمایشگاه نشان می­دهد که برخی DNA و RNA ویروس­های گیاهی، دارای ژن­هایی هستند که خاموشی ژن­ها را سرکوب می­کنند.

محققان معتقدند که فعالیت ضد خاموشی ویروسی به عنوان یک سازوکار برای گریز ویروس­ها از دفاع خاموش کردن ژن­های ویروسی توسط گیاه، تکامل یافته است. صرفنظر از علت و سازوکار فعالیت ضد خاموشی، شاید پدیده سرکوب کردن خاموشی توسط ویروس­ها برای کاهش خاموشی تراژن ها مفید باشد. سرکوبگرهای ویروسی خاموشی ژن­ها، می­تواند تراژن­های پایداری که قبلاً خاموش شده­اند را فعال کند. موضوع جالب دیگر توانایی سرکوبگرهای خاموشی در جلوگیری از تراژن­هایی است که به واسطه انتقال ژن توسط آگروباکتریوم وارد گیاه شدند. گرچه این فرضیه هنوز آزمون نشده و عواقب احتمالی منفی آن (مانند افزایش استعداد آسیب­پذیری نسبت به ویروس­ها) که شاید در پی ادغام پایدار ژن­های ضد خاموشی به داخل ژنوم گیاه پیش آید، آزمایش­هایی که در آنها از سرکوبگرهای خاموشی  ویروسی برای افزایش سطح ابراز موقت تراژن­های منتقل­شده با آگروباکتریوم استفاده شده است، امیدبخش به نظر می­رسند.

وقتی تراژن­های مختلف رمزکننده پروتئین فلورسنت سبز (Greenfluorescent protein)، پروتئین Y Nia ویروس سیب­زمینی یا پروتئین­های مقاومت به بیماری Cf-9 و Cf-4 گوجه­فرنگی به طور همزمان با سرکوبگرهای گوناگون خاموشی ویروسی انتقال می­یابند، ابراز این پروتئین­ها افزایش قابل ملاحظه­ای دارند. سطح ابرازی تا 50 برابر گیاهان تراریخته شاهد (بدون ژن­های سرکوبگر خاموشی ویروسی) به دست آمده است.

چندین سرکوبگر خاموشی ویروسی مختلف مانند پروتئین p25 ویروس PVX، پروتئین P1-HcPro ویروس etch توتون (Tobacco Etch Virus) و پروتئین p19 ویروس TBSV (TomatoBushy Stunt Virus)، توانستند ابراز موقت تراژن­ را با آغازگر 35S (Cauliflower Mosaic Virus 35S=CaMV 35S) و آغازگر معمولی تراژن افزایش دهند. در بین اینها، پروتئین p19 بیشتری تاثیرگذاری را در افزایش ابراز موقت تراژن و کاهش سطح مولکول­های کوچک (21 تا 25 جفت بازی) RNA که در خاموشی پس از رونویسی مشارکت دارند، داشته است.

محققان نتیجه گرفتند که سرکوبگرهای ویروسی خاموشی ژن­ها می­توانند برای تولید مقادیر بالای پروتئین­ها در گیاه مفید باشند.

 

مطلب قبلی در این زمینه: استفاده از نواحی متصل‌شونده به ماتریکس برای رفع خاموشی تراژن

 

Refrence: Stanton B. Gelvin (2003), Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the "Gene-Jockeying" Tool. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67:16-37.


 
comment نظرات ()